HOS TEST: UJI FUNGSI MEMBRAN SPERMA YANG MUDAH DAN EFEKTIF

Benih ternak sapi dalam hal ini adalah semen beku sapi merupakan salah satu faktor penting yang mempengaruhi kinerja produksi dan reproduksi ternak sapi. Produksi semen beku sapi sampai dengan saat ini masih menjadi kewajiban Pemerintah maupun Pemerintah Daerah. Kewajiban ini tercantum dalam Undang-Undang nomor 18 tahun 2009 tentang Peternakan dan Kesehatan Hewan di Pasal 14 pada ayat (1), yaitu “Pemerintah menetapkan kebijakan perbibitan nasional untuk mendorong ketersediaan benih dan/atau bibit yang bersertifikat dan melakukan pengawasan dalam pengadaan dan peredarannya secara berkelanjutan”. Kebijakan dalam produksi dan distribusi semen beku, sebagaimana klausul pasal 14 ayat (1) seyogyanya dapat mendorong pencapaian swasembada pejantan unggul berkelanjutan.

Berdasarkan perhitungan sementara yang dilakukan oleh tim penyusun Roadmap swasembada pejantan unggul  berkelanjutan, kebutuhan semen beku nasional berjumlah kurang lebih 8,3 juta dosis. Jumlah ini terdiri atas produksi semen beku dan stok yang tersedia di tahun 2018. Besarnya permintaan semen beku tersebut tentunya harus diiringi dengan ketersediaan semen beku berkualitas dengan jaminan adanya sertifikat dari LSPro benih dan bibit ternak. Acuan kualitas dimaksud berdasarkan SNI yaitu SNI 4869.1: 2017-Semen beku-Bagian 2: Sapi dan SNI 4869.1: 2017-Semen beku-Bagian 2: Kerbau, dengan parameter yang dipersyaratkan adalah motilitas post thawing minimum 40%, konsentrasi 25 juta per dosis dan motilitas semen segar minimum 70% atau recovery rate minimum 50%. Keempat parameter tersebut ditengarai mampu memprediksi tingkat fertilitas semen beku yang diproduksi. Sementara, ada parameter lain yang juga berperan dalam memberikan gambaran mengenai kualitas semen, yaitu parameter keutuhan membran plasma spermatozoa saat evaluasi fresh semen.

Membran Plasma Utuh (MPU) Spermatozoa

Keutuhan membran plasma menurut Septiyani merupakan suatu keadaan yang menunjukkan fungsi fisiologis membran yang terjaga sebagai kontrol terhadap transport air sehingga cairan diluar sel tidak dapat memasuki sel. Adanya perubahan suhu dan tekanan osmotik yang drastis pada saat proses pembekuan dan thawing. Pada saat pembekuan sel mengalami dehidrasi dan penyusutan karena tekanan hiper-osmotik sedangkan saat thawing terjadi rehidrasi sel mengalami tekanan hipo-osmotik. Hal tersebut tentunya akan mempengaruhi keutuhan membran plasma dalam  mengatur pertukaran zat intra dan ekstraselluler. Dengan demikian, keberadaan membran plasma bagi sperma penting untuk menjaga kelangsungan hidup spermatozoa.

 Penggunaan pengencer oleh balai yang memproduksi semen beku turut memberikan andil terhadap kondisi membran plasma. Adanya perbedaan pengaruh bahan pengencer terhadap membran plasma karena perbedaan rasio lipid penyusun membran dari spermatozoa secara individu, dapat diminimalkan apabila dalam pengencer memilki fungsi sebagai pelindung cold shock dan krioprotektan. Komponen dalam pengencer yang berfungsi tersebut adalah gliserol, kuning telur, susu, low density lipoproteins (LDL), dan lecithin kacang kedelai.  

Respon Positif dari Larutan HOS terhadap Membran Sel Sperma

Hypo-Osmotic Swelling (HOS) Test: Mudah dan Efektif

Metode HOS Test dilakukan untuk memeriksa MPU spermatozoa dengan memaparkan spermatozoa pada larutan hipo-osmosis. Larutan  HOS dibuat dari campuran 0,9 g fruktosa dengan 0,49 g sodium sitrat yang dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 ml. Semen beku (50μl) dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang mengandung 950 μl larutan HOS, kemudian dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37^oC selama 30-45 menit. Kemudian sampel diteteskan ke dalam gelas objek dan ditutup dengan gelas penutup. Evaluasi dilakukan dengan mikroskop  dengan pembesaran 400 kali dari 10 lapang pandang. Menurut Prof. Arifiantini spermatozoa yang memiliki membran plasma utuh ditandai oleh ekor melingkar atau menggelembung. Penghitungan persentase spermatozoa hidup dilakukan sebagai Spermatozoa yang mempunyai membran plasma utuh ditandai dengan pembengkakan bagian kepala dan ekor yang melingkar.

Metode ini belum dilakukan oleh balai inseminasi buatan selaku produsen semen beku sebagai bagian dari prosedur standar produksinya, padahal metode ini relatif mudah dilakukan dan memiliki efektifitas yang tinggi dalam menilai aspek fertilitas semen beku. Kemudahan dimaksud adalah bahwa metode ini hanya membutuhkan larutan HOS dan mikroskop cahaya saja, serta adanya perbedaan yang jelas antara spermatozoa yang memiliki membran utuh (HOS positif) dengan yang memiliki membran rusak (Hos negatif). Metode ini tidak serumit menghitung persentase hidup, yang rawan terjadi bias dalam penghitungan akibat  ketidakterampilan dalam membuat preparat sehingga tidak terlalu terlihat perbedaan antara spermatozoa hidup dengan yang mati.

Metode ini yang dikombinasikan dengan penghitungan parameter motilitas spermatozoa sangat efektif dalam memprediksi kualitas dan potensi fertilitas semen beku yang diproduksi. Secara teori, larutan HOS memaparkan spermatozoa dalam kondisi hipo-osmotik, yang memaksa spermatozoa melakukan pengaturan volume sel agar  larutan di dalam dan di luar sel menjadi seimbang kembali (isotonis). Kerusakan pada membran plasma akan menyebabkan fungsi kontrol terhadap cairan yang masuk akan berkurang sehingga tidak ada spermatozoa tidak dapat merespon perubahan kondisi tersebut. Hal ini berarti hilangnya kemampuan spermatozoa dalam mengatur volume sel agar selalu dalam keadaan iso-tonis.

Dampak kerusakan membran plasma ini disaat pembekuan akan terjadi dehidrasi dan pengkristalan dalam sel spermatozoa yang mengakibatkan kematian sel. Sedangkan saat di thawing terjadi rehidrasi hypotonic shock yang menyebabkan sel kelebihan cairan sehingga fungsi metabolisme sel menjadi terganggu. Dampak kerusakan ini secara otomatis akan mempengaruhi motilitas post thawing,  dan lebih jauh lagi akan menyebabkan keluarnya enzim-enzim yang terdapat dalam tudung akrosom yang digunakan untuk penetrasi ke oovum. Keluarnya enzim tersebut akan berdampak terhadap penurunan tingkat fertilitas semen beku. Dampak buruk akibat kerusakan membran dapat dikurangi dengan pemberian anti cold shock dan krioprotektan dalam pengencer. Akan tetapi secara individual kemampuan sel untuk menjaga keutuhan membran, mungkin diturunkan secara genetik. Artinya pejantan-pejantan yang cenderung memiliki persentase MPU yang tinggi akan dapat mewariskannya kepada keturunannya.

Standar MPU

            Parameter MPU belum masuk ke dalam persyaratan teknis SNI mengenai semen beku, maupun di dalam prosedur standar produksi di balai. Nilai standar untuk parameter ini dapat mengadopsi pada Minimum Standards for Production of Bovine Frozen yaitu minimal 40% . Penambahan parameter MPU pada prosedur produksi balai tentunya diharapkan akan dapat meningkatkan kualitas semen beku yang diproduksi. Pemeriksaan  MPU dapat terapkan pada saat evaluasi semen segar dan saat thawing. Pemeriksaan MPU di semen segar untuk memperoleh informasi dasar mengenai fungsi membran plasma spermatozoa sebelum dibekukan. Pemeriksaan MPU saat thawing untuk memperoleh informasi terkait efektifitas pengencer sebagai pelindung terhadap cold shock dan krioprotektan. Dengan demikian, pemeriksaan MPU melalui uji HOS test dapat menjadi salah satu metode untuk menguji kualitas semen baik sapi maupun kerbau yang mudah dilakukan dan efektif.